Susceptibilidad in Vitro Frente a Diversos Antifúngicos de Cándidas spp. Procedentes de Pacientes con el VIH con y sin Candidosis oral. Comparación de dos Métodos.

Presentación oral en  el Simposio CILAD 2006, Punta Cana, República Dominicana, Julio 2011.

Noris Salcedo,  Laboratorio Veterinario Central (LAVECEN) Santo Domingo, República Dominicana. Junio 2006
E-mail: ncsalcedo@gmail.com

Resumen
Estudiamos las posibles diferencias en el patrón de sensibilidad a Fluconazol, Ketoconazol, Clotrimazol y Nistatina  de un total  30 aislamientos de Cándida spp. procedentes de  pacientes infectados por el VIH,  con o sin candidosis oral, y un grupo control VIH negativo  con candidosis oral. Para ello, se eligieron cepas de cándidas procedentes de la cavidad oral de 18 pacientes tomadas  de un estudio anterior, procesadas por métodos micológicos convencionales y mantenidas  en agua destilada a 4 grados centígrados. De acuerdo a los resultados obtenidos  la  Nistatina y Clotrimazol fueron las drogas más efectivas contra las cepas de Cándidas estudiadas  seguidas  del Ketoconazol mostrando muy baja resistencia   al Fluconazol en las cepas de Cándidas no albicans. El método de referencia Neo-Sensitabs  estuvo en concordancia con el método de discos impregnados en un  93 %.

Métodos:

La sensibilidad a los antifúngicos se determinó por  el método de difusión en Agar Neo-Sensitabs® y con el método de difusión en Agar usando  discos  impregnados con los principios activos de Fluconazol  (25 µg /mL), Clotrimazol (10 µg /mL), Ketoconazol (15/mL), procedentes de un laboratorio Farmacéutico Privado.
Objetivo: comparar la actividad  de los antifúngicos y establecer las diferencias en la susceptibilidad de Cándidas albicans y no albicans,  en los tres grupos de estudio.

 

Resultados

Los hallazgos para la sensibilidad  presentaron un comportamiento altamente diferenciado entre las especies en término de resistencia. Ambos métodos demostraron ser eficaces y de resultados comparables.

 

Palabras clave: Antifúngicos, Cándida spp., VIH, candidosis oral.

Abstract

We are studying the possible differences in the pattern of sensitivity to Fluconazole, Ketoconazole, Clotrimazole and Nystatin for a total 30 isolates of Candida spp. from  patients infected with HIV, with or without oral candidiasis, and a group from HIV-negative control with oral candidiasis.  Candida strains were chosen for this, from the oral cavity of 18 patients taken from an earlier study, processed by conventional Mycological methods and maintained in distilled water at 4 degrees Celsius. According to results, the Nystatin and Clotrimazole were more effective drugs against the strains of Candidas studied followed by ketoconazole, found very low Fluconazole resistance in strains of Candidas no albicans. The Neo-Sensitabs reference method was in accordance with the method of discs impregnated by 93%.

INTRODUCCIÓN

El aumento del número de infecciones  por levaduras, el incremento de fármacos antifúngicos y la aparición de resistencias a éstos ha llevado a los laboratorios de microbiología clínica a la necesidad de conocer la sensibilidad Antifúngica in vitro de sus aislamientos [1].

Las lesiones de las mucosas orales han sido ampliamente asociadas a estados de inmunodepresión y son indicadores de la infección VIH [2-4]. El diagnóstico, tratamiento y control de la candidosis es importante dentro de las pautas terapéuticas del sida y está basado en el empleo racional de antimicóticos azólicos, principalmente de Fluconazol (FLZ) [5-9]. Aunque es indudable el valor terapéutico de los antifúngicos azólicos, en los últimos años se han observado episodios de candidosis orales que no respondían adecuadamente a este tratamiento y se han descrito aislamientos clínicos de Cándida que eran resistentes in vitro a Ketoconazol (KTZ), FLZ [10-12]. Por otra parte, no se ha establecido si la patogenicidad de los aislamientos y su relación con la manifestación clínica de la infección candidósica tiene relación con una menor sensibilidad in vitro a los antifúngicos empleados.

El objetivo de este trabajo ha sido determinar la sensibilidad in vitro a los antifúngicos de uso habitual, como  Nistatina (NIST), Fluconazol ( FLZ), Clotrimazol (CLTZ) y Ketoconazol (KTZ), de las cepas de Cándida aisladas de pacientes infectados con el VIH  y un grupo control  valorando la presencia o no de candidosis oral

 

MATERIALES Y METODOS

 

El estudio se realizó con  30 cepas obtenidas de muestras de  cavidad oral de18 pacientes adultos (9 hombres y 9 mujeres), con edades entre  (19- 65 años), que participaron en un estudio anterior y que fueron aceptados según protocolo de consentimiento informado, los cuales acudieron  a la consulta del departamento de Infectologia del Hospital Salvador B. Gautier, Instituto Dermatológico y Cirugía de la Piel departamento  (ETS), Centro Sanitario, Instituto de Investigaciones Virológicas Y Hospital Padre Billini. Dichas  muestras tomadas con hisopos se colocaron en tubos estériles con tapa de rosca  conteniendo solución salina (0.85%) estéril y fueron enviadas al laboratorio, donde se procesaron en busca de Cándidas spp. Dichas cepas fueron conservadas en agua destilada estéril   a 4° C. La identificación se llevo a cabo mediante procedimientos habituales (macroscópicos, microscópicos y bioquímicos).
Once (11) cepas fueron aisladas de pacientes  infectados con el VIH y candidosis oral, de las cuales 5 corresponden a Cándida albicans, 4 a Cándida guillermondii, 1 a Cándida parapsilosis, y 1 a Cándida tropicalis. Once (11) cepas fueron aisladas de pacientes no infectados con el VIH con candidosis oral, de las cuales 5 eran C. albicans, 4 C. famata, 1 C. guillermondii, y 1 C. krusei (grupo control). Por ultimo 8 cepas procedían de pacientes  infectados con el VIH asintomáticos o con colonización oral, de las cuales 5 eran C. albicans, y 3 C. guillermondii.

 

PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD

 

Los ensayos in vitro de sensibilidad Antifúngica son problemáticos por los factores que pueden influir en su resultado, tales como el tipo de microorganismo, el tamaño del inóculo, el medio empleado, las condiciones de incubación y el método de lectura e interpretación(17), así mismo, la laboriosidad de los métodos de referencia propuestos por los NCCLS (35), para la realización de las pruebas de sensibilidad in vitro a los distintos antifúngicos hace difícil su incorporación a la rutina del laboratorio.

 

METODO DE DIFUSION EN AGAR USANDO TABLETAS

 

Para la  Metodología se usaron las tabletas de  Neo-Sensitabs (manufactured by Rosco in Denamrk) de (Nistatina, 50 µg; Ketoconazol, 15 µg; Fluconazol, 25 µg; Clotrimazol, 10 µg /mL),  las cuales miden 9 mm y contienen agentes antimicrobianos cristalinos mezclados cuidadosamente con un granulado para su protección. Estas tabletas se emplean en los ensayos semicuantitativos in Vitro realizados para conocer la sensibilidad a los antifúngicos. Se utilizó  Shadomy Agar modificado el cual es un medio tamponado con una base de levadura nitrogenada, glucosa y asparragina. Este medio fue  inoculado con cultivos puros de aislamientos  clínicos a estudiar,  diluidos  1+1 de una suspensión celular ajustada a 0,5 McFarland (más diluida, 1:10 en el caso de Candida krusei) y luego sobre   la superficie del medio así preparado,  se colocaron las tabletas o los discos, se incubaron las placas a 35°C y la lectura de los halos de inhibición  a las 24 h.

Los diámetros de los halos de inhibición fueron medidos con regla milimetrada y las cepas fueron clasificadas como resistentes, sensibles, y  de sensibilidad intermedia o dosis-dependiente al antifúngico estudiado, en virtud del diámetro del halo de inhibición (DHI). Los criterios de los diámetros de zona para cada país se pueden encontrar en el Neo-Sensitabs User’s Guide (manual del usuario de Neo-Sensitabs)  www.rosco.dk (34).  Las tabletas Neo-Sensitabs han sido estandarizadas de acuerdo con los valores límite (puntos de corte) de concentración mínima inhibitoria (MIC) recomendados por el CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute)  y el NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) (35).

La clasificación por categorías de:sensible ( ³ 15 mm), de sensibilidad intermedia (14-10 mm) o resistente (≤ 9 mm) a NIST; sensible (³30 mm), de sensibilidad intermedia (29-23 mm) o resistente (³ 22 mm) a KTZ. Para  FLZ; sensible (³ 22 mm); de sensibilidad intermedia (21-15 mm),  resistente (≤14) a CLOTR, (³ 20 mm), intermedia (19-12), resistente (≤ 11), se hicieron de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes [15,16].

MÉTODO DE DIFUSIÓN EN AGAR USANDO DISCOS IMPREGNADOS

Se usaron discos blancos estériles de la marca (Difco Laboratories) los cuales fueron   impregnados con los principios activos de Fluconazol  (25 µg /mL), Clotrimazol (10 µg /m),  Ketoconazol (15 µg /mL), con una potencia de 99.27%, 100.5% y 99.4 respectivamente, utilizados para la fabricación de  los  medicamentos en una compañía farmaceutica privada. De  la solución de trabajo (conservadas en crioviales a una temperatura de -70°C),  fueron preparados los discos con  un volumen de  10 μl de las respectivas soluciones y secados en estufa, preservándose  en desecador a temperatura de 4°C, hasta su uso.

INÓCULO.

Las levaduras aisladas fueron conservadas en agua deshionizada y subcultivadas en Sabouraud dextrose agar (BBL, Cockeysville, Md.) para asegurar la pureza y viabilidad (33), y luego subcultivadas otra vez para la selección de las colonias. Se preparó una suspensión  eligiendo de tres a 5 colonias cada una de al menos 1 mm de diámetro (de cultivos de 24 horas) en 5.0 ml de agua deshionizada  estéril y mezcladas con en un mezclador vortex Fisher Scientiffic Cat. 12-812. Dicha suspensión fue ajustada a una turbidez comparada con el Standard 0.5 McFarland, la cual a su vez fue diluida 1+1 para usarse en placas de 90 mm de diámetros, en el caso de C. krusei la dilución fue de 1:10. Después de la inoculación del microorganismo, las placas fueron dejadas para su secado de 5-15 minutos a 37 grados y luego se colocaron los discos con los diferentes antifúngicos sobre el Agar conteniendo el inoculo. Las placas fueron incubadas de 18-24 horas a 35-37° y para los crecimientos lentos se leyeron a las 48 horas de incubación.

EL CONTROL DE CALIDAD

Se realizo usando cepas de referencia ATCCC  American Type Culture Collection, EE.UU.,  las cuales tienen los siguientes sensibilidades: C. albicans ATCC 64548 sensible a todos los antifúngicos estudiados, Cándida albicans ATCC 60193, Cándida parapsilosis ATCC 22019 sensible a FLZ (DHI= 33-35  mm) y C. krusei ATCC 6258 resistente a FLZ (DHI= 11-14  mm). Tales cepas  fueron chequeadas una vez por  semana. Los resultados con un rango fuera del control de calidad fueron excluidos. La precisión fue determinada por la realización de las pruebas por triplicado (leídas simultáneamente  por dos Bioanalistas), para asegurar la reproductividad de los resultados con ambos   métodos.

 

RESULTADOS

 

De las 30 cepas  se obtuvieron 15 de Cándida albicans, 8 de C. guillermondii, 4 C. famata, 1 C. tropicales, 1 C. parapsilosis, 1 C. krusei.

Ninguna de las 30 cepas presentó resistencia al Clotrimazol o Nistatina, sin embargo, se observaron resistencias in Vitro al Fluconazol en el 13.3 % de los aislamientos y en un 9 % de los mismos con sensibilidad intermedia al Ketoconazol. Las cepas de C. krusei, C. tropicales y 2 de C. guillermondii resultaron resistentes al Fluconazol.  El 54% de los aislamientos de pacientes VIH  con candidosis y el 12.5% de los  pacientes VIH colonizados por Cándida mostraron una sensibilidad disminuida a los azoles, mientras que en el grupo VIH negativo pero con candidiasis (Grupo control), solo mostró un 27% de resistencia disminuida a los azoles.

El presente estudio muestra que los antifúngicos azólicos tienen buena eficacia in Vitro sobre los aislamientos de pacientes infectados por el VIH,  y la resistencia in Vitro a los azoles esta en relación a lo encontrado por otros autores. Por tanto, la disminución en la sensibilidad de Cándida spp. procedentes de aislamientos de pacientes VIH positivos, debe ser tenida en cuenta a la hora de establecer una terapia Antifúngica específica

La identificación de las cepas se realizó por métodos convencionales [13]. Se identificaron 15 Cándida albicans, de las cuales 2 eran de sensibilidad intermedia al Fluconazol, 8 C. guillermondii, 2 de ellas con resistentes al Fluconazol y 2 de sensibilidad intermedia, 4  C. famata  sensible a todos los antifúngicos, 1 C. tropicales resistente al Fluconazol, y con sensibilidad intermedia  al Ketoconazol, 1 C. parapsilosis sensible a todos los antifúngicos y 1 C. krusei resistente al Fluconazol.

Ninguno de los 30  aislamientos fue resistente in Vitro a la Nistatina y Clotrimazol.  En cuanto a los tratamientos que estaban usando los pacientes al momento de la toma de la muestra reveló que 9 cepas procedían de 5 pacientes que estaban siendo tratados con FLZ, bien como terapia profiláctica intermitente o como tratamiento continuo, se aisló Cándida no albicans  en más de la mitad de estos pacientes (55,6%). Cuatro  cepas procedentes de 5 pacientes que estaban usando Fluconazol, 3(75%) eran resistente in vitro al FLZ, la otra resistente al FLZ  procedía de un paciente del cual no se reporto o se desconocía  el tratamiento.

De las 11 cepas obtenidas de pacientes infectados con VIH y con candidosis oral, tres (27 %) fueron resistentes al FLZ, uno de estos con sensibilidad intermedia cruzada al KTZ (9%). Una Cepa (C.guillermondii) de este grupo resultó de sensibilidad  intermedia al FLZ. De los 8 aislamientos de pacientes sin candidosis, uno (12,5 %) fue de sensibilidad intermedia  al FLZ. De los 11 cepas aisladas de pacientes no infectados al VIH pero con síntomas de candidiasis oral (grupo control), 1 (9%) fue resistente al FLZ, y 2 (18%) eran de sensibilidad intermedia o dosis dependiente al FLZ,  (tabla 1).

 

ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Los datos recibieron un tratamiento estadístico utilizando el método de comparación de porcentajes para muestras independientes, con el fin de establecer diferencias en las respuestas a  los distintos antifúngicos entre las cepas.  Se  calculo la susceptibilidad (S), resistencia a los azoles (R), y la susceptibilidad dosis dependiente (SDD) o Intermedia (I) de todas las cepas.

 

Tabla 1. Sensibilidad disminuida a los antifúngicos azólicos según la procedencia clínica de los aislamientos.
Porcentaje de aislamientos de
Pacientes VIH con candidosis				Pacientes VIH con colonización				Pacientes no VIH con
		(n=11)			(n=8)			Candidosis	(n=11)
	I	R	total	I	R	total		I	R	total
Antifúngicos
Fluconazol	2(18)	3(27)	45	1(12,5)	0	12,5		2(18)	1(9)	27
Ketoconazol	1(9)	0	9	0	0	0		0	0	0
Clotrimazol	0	0	0	0	0	0		0	0	0
	27%	27%	54%	12,.5%		12,5%		18%	9%	27%

 

Tabla # 2. Correlación de la sensibilidad a los antifúngicos azólicos de las cepas Cándidas obtenidas de Cavidad oral según los métodos
CEPAS (n)	NEO-SENSITABS											DISCOS IMPREGNADOS
	FLZ			CLOTR			KTZ				FLZ			CLOTR			KTZ
	S	I	R	S	I	R	S	I	R		S	I	R	S	I	R	S	I	R
C.albicans        (15)	13	2	0	15	0	0	14	1	0		13	2	0	15	0	0	15	0	0
C.guillermondii  (8)	4	2	2	8	0	0	8	0	0		4	2	2	8	0	0	8	0	0
C.famata           (4)	4	0	0	4	0	0	4	0	0		4	0	0	4	0	0	4	0	0
C.tropicalis        (1)	0	0	1	1	0	0	0	1	0		0	0	1	1	0	0	0	1	0
C.parapsilosis   (1)	1	0	0	1	0	0	1	0	0		1	0	0	1	0	0	1	0	0
C.krusei            (1)	0	0	1	1	0	0	1	0	0		0	0	1	1	0	0	0	0	0

 

La correlación de los dos métodos usados fue  interpretada al evaluar los resultados de   los diferentes grados de sensibilidad  de las 30 cepas en estudio. Las discrepancias fueron menores reflejándose en una cepa la cual  pertenecía a  C. albicans del grupo VIH sintomático, que con el método de las tabletas resultó de sensibilidad intermedia al KTZ  y con el método de disco fue sensible. (Tabla 2).

El método de referencia Neo-Sensitabs  estuvo en concordancia con el método de discos impregnados en un  93 %. La reproductividad de los resultados con el método de disco fue comparable con el método Neo-Sensitabs el cual a su vez es  aceptado por el National Committee for Clinical Laboratory Standard (NCCLS) (34), demostrando en ambos métodos  buena actividad para los azoles.

En cuanto a  la resistencia  se presentó en   3 de 11 cepas al FLZ  en los  aislamientos que procedían de pacientes infectados con el VIH   con  candidosis,  mientras que en el  grupo VIH negativo pero  con  candidosis  en 1 de 11 hubo resistencia al FLZ. No se encontró resistencia  a ninguno de los antifúngicos en el grupo VIH positivo pero con colonización, ni resistencia de C. albicans al Fluconazol.

 

DISCUSIÓN

 

La infección oportunista más frecuente en pacientes con VIH es la Cándida, y la especie que más prevalece es la Cándida albicans por lo que la  identificación de la especie, susceptibilidad antigungica, control y tratamiento de esta infección juega un papel fundamental en la evolución de la enfermedad de estos pacientes. El tratamiento curativo y/o profiláctico se ve influido por diferentes factores, entre los que es importante la posible aparición o selección de cepas resistentes a los antifúngicos [10].

 

En los  primeros años de la década de los 1990s, se empezaron a comunicar casos de candidosis orofaríngeas que no respondían al tratamiento en pacientes infectados con el VIH que habían recibido FLZ de forma prolongada o reiterada [10-12]. Una situación similar había sido descrita para el KTZ, asociándose el fracaso del tratamiento con la aparición de cepas resistentes [5] En el presente estudio, no hemos encontrado aislamientos clínicos resistentes a NIST y CLOTR. lo que concuerda con la mayoría de los estudios realizados anteriormente [17,18]. Sin embargo, alrededor del 13.3% de las 30 cepas evaluadas mostraron resistencia in vitro a FLZ. Estos resultados son inferiores a los publicados por otros autores [19-22], cuyos porcentajes de cepas resistentes oscilan entre el 14 y el 41%.
La gran mayoría de los casos resistentes al tratamiento se han observado en pacientes que han recibido un tratamiento prolongado con FLZ [23], existiendo cierta controversia entre si lo que favorece la aparición de resistencia es la terapia continua o intermitente [24]. En el presente trabajo de 4, 3 aislamientos resistentes al FLZ provenían de pacientes que estaban o habían estado en tratamiento prolongado con FLZ, lo que parece apoyar el hecho de que el tratamiento prolongado con este fármaco promueve la aparición de cepas resistentes.

Todos las cepas resistentes eran de especies distintas de C. albicans, 2 C. guillermondii, 1   C. krusei y 1 C. tropicalis, las cuales  procedían  de pacientes que estaban usando FLZ, excepto la de C. krusei, la cual procedía de un paciente de tratamiento desconocido y es intrínsecamente resistente al FLZ .  Autores como Ruhnke, en Alemania [25] y Drobacheff, en Francia [21] encuentran en algunos de los pacientes sometidos a tratamientos repetidos con FLZ, resultados similares a los obtenidos por nosotros, lo cual sugiere la importancia de la identificación de las especies para los fines del tratamiento.

El método de difusión de disco usando las tabletas Rosco no estuvo en 100% en correlación con el método de difusión de discos en Agar usando los discos impregnados con nuestros azoles,  pero  refuerza la utilidad del método empleado en el presente trabajo como herramienta para ofrecer resultados confiables con adecuada estandarización, de fácil uso y buena correlación costo/beneficio.

En nuestro estudio, una cepa de Cándida tropicalis  resistente al FLZ,  mostró también sensibilidad intermedia al  KTZ. Estos datos sugieren que los aislamientos clínicos de Cándidas resistentes y/o intermedia o dosis dependiente  al FLZ, después de su uso terapéutico prolongado, muestran resistencia cruzada con otros azoles, como ITZ (no usado en este estudio) y KTZ.

 

Otros autores han descrito aislamientos resistentes a diferentes azoles, como KTZ [13] o ITZ y KTZ [22,28-30], aunque la frecuencia de resistencia cruzada ha sido baja: dos de 32 aislamientos, en uno de los trabajos [28] y dos  de 51, en el otro [2]. Johnson et al. [29] observaron que muchos de los aislamientos resistentes in vitro al FLZ de pacientes en tratamiento prolongado con FLZ, eran sensibles al KTZ, lo que sugiere que la resistencia cruzada no ocurre en todos los casos.

Los antifúngicos orales sistémicos se consideran los más indicados para el tratamiento de las candidosis orofaríngeas en los pacientes con infección VIH. Sin embargo, en ambos casos se producen recidivas y fallos en el tratamiento.

Nuestros datos sugieren que el método de difusión Neo-Sensitabs® puede proveer un simple procedimiento para la susceptibilidad a  los antifúngicos  así como el método evaluado de  discos impregnados con los antifúngicos nacionales usados en nuestro trabajo.

 

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

De acuerdo a los resultados obtenidos podemos concluir que la  Nistatina y Clotrimazol fueron las drogas más efectivas contra las cepas de Cándidas estudiadas  seguidas  del Ketoconazol, encontrándose  muy baja resistencia solamente  al Fluconazol en las cepas de Cándidas no albicans.

Las cepas de C. no. albicans resultaron  resistentes al FLZ en un (13.3%) y la C. Albicans en un  (0%), por lo que es recomendable el cultivo e  identificación de las cepas, así como la realización de las pruebas de susceptibilidad  para aplicar una terapia adecuada, sobre todo cuando se trata de aislamientos de C. no albicans .

La evaluación del método de discos  demostró excelente reproducibilidad para ser aplicado en la práctica clínica, por ser un método sencillo, comparable a los reportados por otros autores, con un aceptable grado de correlación,  de fácil manejo en comparación con los laboriosos métodos de referencia existentes y sobre todo de menor costo.

Es recomendable obtener mayor información sobre el tratamiento previo de los pacientes y el numero de   episodios de candidosis sufridos, con la finalidad de establecer si existe o no relación con la posterior aparición de resistencia, requiriéndose nuevos estudios similares con mayor número de cepas.

 

Un programa de monitoreo de la resistencia de las levaduras a los antimicóticos, en los aislamientos de pacientes infectados con el VIH y aquellos inmunocompetentes pero con recurrencia,  antes de iniciar el tratamiento y durante el  mismo, debería de ser establecido para evitar recurrencia de candidosis.

 

AGRADECIMIENTOS

 

A la Lic. Laura Créales y al personal de Medios de Cultivos del LAVECEN, por su dedicación y esmero puesto en su trabajo.

A la Licda. Rosario Montes de Oca por su asistencia en el control de calidad.

Al Dr. Miguel Lora por el estudio estadístico y a la Dra. Beatriz Cuevas quien gentilmente ayudo de una u otra forma a este trabajo.

Al Dr. Stefano B., Lic. Mercedes Matos (Venezuela) y Dra. Susana Córdoba (Argentina), por sus comentarios y sugerencias.

Al Dr. Rafael Isa Isa, Dr. Arthur Nouel, Dr. Claudio Vólquez, Dra. Lina José, Yesenia Peña, Nuria Usi, Lida. Teresa Rodríguez González,   Dra. Mónica Thorman, Dra. Ivelisse Garris,  Dra. Ellen Koening, Dr.Gladstone Cumberbath, Brea Tió,   por el apoyo institucional y  la facilidad prestada  para la obtención de las muestras a los pacientes en el primer estudio. A Franja Comercial por la donación de Medios ChromAgar cándida.

A la Dra. Shor-Posner, FIC Director of Fogarty Internacional Training Programan (University of Miami) por su gran apoyo y financiamiento para los entrenamientos internacionales.
Un especial agradecimiento al Sr. Donato Peña de los Laboratorios Antillanos Edmar S.A, LAANED, por el patrocinio  y la gran contribución brindada para la realización de este trabajo.

Muchas otras personas que colaboraron en este estudio directa o indirectamente me excuso de no citarlas

 

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